WikiDer > Жарық өрісінің микроскопиясы

Light field microscopy

Жарық өріс микроскопия (LFM) теориясына негізделген сканерлеусіз 3-өлшемді (3D) микроскопиялық бейнелеу әдісі болып табылады жарық өрісі. Бұл әдіс екінші секундқа (~ 10 Гц) көлемді кескін жасауға мүмкіндік береді ([~ 0,1-ден 1 мм-ге дейін)3) әлсіз шашырау және жартылай мөлдірлік жағдайында ~ 1 мкм кеңістіктік ажыратымдылықпен, бұған дейін басқа әдістермен қол жеткізілмеген. Дәстүрлі сияқты жеңіл өрісті көрсету, LFM бейнелеу үшін екі кезең бар: жарық өрісін түсіру және өңдеу. Көптеген қондырғыларда а микролендер массив жарық өрісін түсіру үшін қолданылады. Өңдеуге келетін болсақ, ол жарықтың таралуының екі түріне негізделуі мүмкін: сәулелік оптика сурет[1] және толқындық оптика сурет.[2] Стэнфорд университетінің компьютерлік графика зертханасы өздерінің алғашқы прототипін LFM-ді 2006 жылы шығарды[1] және сол кезден бастап жұмыс істейді.

Жеңіл өрісті қалыптастыру

Жарық өрісінің микроскопиясының сәулелік параметрлері. (A) Кез-келген релелік линзасыз жарық өрісінің параметрлері. Нысан жазықтығы микролендер массив жазықтығымен объективті, ал объективті жазықтық датчик жазықтығымен микролинзалар арқылы конъюгацияланады: екі нүктенің аралық бейнесі микролендердің массив жазықтығында, бір нүктеге сәйкес келетін бір микроленнде; сәйкес микролендердің артындағы әрбір кіші сурет мақсаттың бейнесін қосады. (B) Релелік жүйемен жарық өрісінің параметрленуі. Фокустық жазықтықтағы нүктелер мен мироленсалар арасындағы конъюгация әлі де қалады; дегенмен, әр микроленнің артындағы кіші сурет мақсаттың бір бөлігін ғана қамтиды. Екі жүйеде де сәуле сәуле өтетін микролендердің 2D координатасы және ол түсетін субмерингтік пиксельдің 2D координатасының тіркесімі ретінде параметрленеді.

Жарық өрісі дегеніміз - әрбір сәулені төрт айнымалымен параметрлеуге болатын кейбір бос кеңістіктен өтетін барлық сәулелердің жиынтығы.[3] Көп жағдайда екі өлшемді екі координаталар -мен белгіленеді & - параметрлеу үшін сәулелер қиылысатын екі параллель жазықтықта. Тиісінше, 4D жарық өрісінің қарқындылығын скалярлық функция ретінде сипаттауға болады: , қайда - бұл екі жазықтық арасындағы қашықтық.

LFM кең өрісті флуоресценттік микроскоптың дәстүрлі қондырғысы және стандарт бойынша құрылуы мүмкін CCD камерасы немесе sCMOS.[1] Аралық кескін жазықтығына микролендер массивін орналастыру арқылы жарық өрісі пайда болады объективті (немесе қосымша релелік линзаның артқы фокустық жазықтығы) және одан әрі камера сенсорын микролинзалардың артқы фокустық жазықтығына орналастыру арқылы түсіріледі. Нәтижесінде микролинзалардың координаттары объект жазықтығындағы конъюгация (егер қосымша релелік линзалар қосылса, онда объектінің алдыңғы фокустық жазықтығында) ; әрбір микроленаның артындағы пикселдердің координаттары объективті жазықтықтағылармен конъюгациялау . Біртектілік пен ыңғайлылық үшін біз ұшақты шақырамыз осы мақалада бастапқы фокустық жазықтық. Тиісінше, - микролинзалардың фокустық қашықтығы (яғни микролендердің массив жазықтығы мен датчик жазықтығы арасындағы қашықтық).

Сонымен қатар, саңылаулар мен әр линзаның фокустық қашықтығы мен сенсор мен микролендер жиымының өлшемдері сәйкес микролинзалардың артында көршілес кіші кескіндер арасында бір-бірімен қабаттаспайтын және бос жерлер болмайтындай етіп дұрыс таңдалуы керек.

Сәулелік оптика суретінен жүзеге асыру

Бұл бөлім негізінен Левойдың шығармашылығымен таныстырады т.б., 2006.[1]

Әр түрлі жағынан перспективалық көріністер

Жоғарыда айтылғандай байланыстырылған қатынастардың арқасында кез-келген нақты пиксель артында белгілі бір микролен нүкте арқылы өтетін сәулеге сәйкес келеді бағытқа қарай . Сондықтан пиксельді шығару арқылы барлық кіші суреттерден және оларды біріктіруден белгілі бір бұрыштан перспективалық көрініс алынады: . Бұл сценарийде кеңістіктік ажыратымдылық микролиздердің санымен анықталады; бұрыштық ажыратымдылық әрбір микроленаның артындағы пикселдер санымен анықталады.

Синтетикалық қайта шоғырландыруға негізделген томографиялық көріністер

1-қадам: Сандық қайта бағыттау

Жарық өрісінің сандық бағыты. Түпнұсқа кескін микролендер массивінің жазықтығымен түйісетін жазықтыққа бағытталған деп есептейік, осылайша кескінді осы жазықтыққа фокустай отырып, әр микроленонның артында пиксельдерді қосу арқылы синтездеу керек. Енді біз коньюгацияланған жазықтық α болатын басқа жазықтыққа тоқталғымыз келедіf микролендердің массив жазықтығы мен датчик жазықтығы арасында анықталған сәулелерді шығару арқылы сенсор жазықтығынан алшақ. Фокустық жазықтықтағы әр нүктенің интенсивтілігін алу үшін кері кеңейту сызықтары осы нүктеге жететін сәулелерді қосамыз. Бұл сурет 1-өлшемді синтетикалық қайта шоғырландыруды көрсету болып табылады, ал басқа өлшемді дәл сол математикалық тәсілмен қайта бағыттауға болады. Бұл сурет Рен Нг 2005 жылғы 1-суреттің модификациясы болып табылады.[4]

Синтетикалық фокустау кез-келген ерікті бөлімге фокусты фотосуретті есептеу үшін түсірілген жарық өрісін пайдаланады. Микролендердің артындағы әр субсуреттегі барлық пиксельдерді қосқанда (бір позицияға түсетін әр түрлі бұрыштардан келетін барлық сәулеленуді жинауға тең), сурет микролендердің массив жазықтығымен түйісетін жазықтыққа дәл бағытталған:

,

қайда - бұл сәуле мен сенсор жазықтығының нормалы арасындағы бұрыш, және егер әрбір кіші суреттің координаттар жүйесінің бастамасы сәйкес микролендердің негізгі оптикалық осінде орналасқан болса. Енді тиімді проекция коэффициентін сіңіру үшін жаңа функцияны анықтауға болады жарық өрісінің қарқындылығына және әрбір пикселдің нақты сәулелену жиынтығын алу: .

Объективтің алдыңғы фокустық жазықтығынан басқа басқа жазықтыққа назар аудару үшін, айталық, коньюгацияланған жазықтық болатын жазықтық алыс сенсорлық жазықтықтан, коньюгацияланған жазықтықтан жылжуға болады дейін және оның жарық өрісін бастапқыға қайтарыңыз :

.

Осылайша, қайта өңделген фотосуретті келесі формуламен есептеуге болады:

.

Демек, объектілік кеңістіктің 3D кескінін жедел қайта құру үшін фокалды стек жасалады. Сонымен қатар, қисайған немесе тіпті қисық фокустық жазықтық синтетикалық мүмкін.[5] Сонымен қатар, ерікті тереңдікке бағытталған кез-келген қалпына келтірілген 2D кескіні 4D жарық өрісінің 2D кесіндісіне сәйкес келеді Фурье домені, мұнда алгоритмнің күрделілігін төмендетуге болады дейін .[4]

2-қадам: нүктелік спрэд функциясын өлшеу

Дифракция мен дефокустың арқасында фокальды қабат воксельдердің интенсивті таралуынан ерекшеленеді , бұл шынымен қалаған. Оның орнына, болып табылады және нүктелік таралу функциясы (PSF):

Осылайша, PSF-тің 3D формасын оның әсерін азайту және воксельдердің таза қарқындылығын алу үшін өлшеу керек. Бұл өлшеуді флуоресцентті моншақты бастапқы фокустық жазықтықтың ортасына орналастыру және оның жарық өрісін жазу арқылы оңай жасауға болады, соның негізінде PSF-нің 3D пішіні синтетикалық түрде әр түрлі тереңдікке назар аудару арқылы анықталады. PSF фокустық стек сияқты LFM қондырғысымен және қайта цифрлық қайта өңдеу процедурасымен алынғандығын ескере отырып, бұл өлшеу мақсатпен түсірілген сәулелердің бұрыштық диапазонын дұрыс көрсетеді (қарқындылығы кез-келген түсуді қоса); сондықтан бұл синтетикалық PSF шынымен де шу мен ауытқуларсыз. PSF пішіні біз қалағандай барлық жерде бірдей деп санауға болады көру өрісі (FOV); сондықтан бірнеше өлшемдерден аулақ болуға болады.

3-қадам: 3D деконволюциясы

Фурье доменінде воксельдердің нақты қарқындылығы фокалды стекпен және PSF-мен өте қарапайым қатынаста болады:

,

қайда операторы болып табылады Фурье түрлендіруі. Алайда апертураның өлшемі шектеулі екенін ескере отырып, жоғарыдағы теңдеуді тікелей шешу мүмкін болмауы мүмкін, нәтижесінде PSF шектелген (яғни оның Фурье түрлендіруінің нөлдері бар). Оның орнына қайталанатын алгоритм деп аталады шектеулі итеративті деконволюция кеңістіктік доменде бұл жерде әлдеқайда практикалық:[6]

  1. ;
  2. .

Бұл идея градиенттің төмендеуіне негізделген: бағалау нақты фокустық стек арасындағы айырмашылықты есептеу арқылы итеративті түрде жақсарады және бағаланған фокустық стек және түзету ағымдағы айырмашылықпен ( теріс емес деп шектеледі).

Толқындық оптика суретінен жүзеге асыру

Сәулелік-оптикалық негізде болса да пленоптикалық камера макроскопиялық әлемде қолайлы өнімділік көрсетті, дифракция сәулелік-оптикалық тілмен қалғанда LFM қайта құруға шек қояды. Демек, толқындық оптикаға ауысу әлдеқайда ыңғайлы болуы мүмкін. (Бұл бөлім негізінен Брокстонның жұмысымен таныстырады т.б., 2013.[2])

Кеңістікті дискреттеу

Мүдделі FOV сегменттелген воксельдер, әрқайсысы жапсырмасы бар . Осылайша, бүкіл FOV вектормен дискретті түрде ұсынылуы мүмкін өлшемімен . Сол сияқты, а вектор әрбір элемент орналасқан сенсор жазықтығын білдіреді бір сенсор пикселін білдіреді. Әр түрлі вокельдер арасында когеренттік емес таралу жағдайында жарық өрісінің объектілік кеңістіктен сенсорға өтуін сызықтық байланыстыруға болады PSF ақпараты енгізілген өлшеу матрицасы:

Сәулелік-оптикалық сценарийде сәулелерді синтетикалық фокустау арқылы фокустық стек пайда болады, содан кейін жарықтың толқындық табиғатынан туындаған бұлыңғырлықты азайту үшін синтезделген ПСФ-мен деконволюция қолданылады. Толқынды оптикалық суретте, керісінше, өлшеу матрицасы - жарық өрісінің таралуын сипаттау – толқындардың таралуына негізделген. PSF формасы инвариантты болатын өтпелі оптикалық микроскоптардан айырмашылығы (мысалы, Әуе үлгісі) эмитенттің позициясына қатысты әр воксельдегі эмитент LFM сенсорында ерекше үлгі жасайды. Басқаша айтқанда, әрбір баған анық. Келесі бөлімдерде барлық өлшеу матрицасын есептеу егжей-тегжейлі талқыланады.

Оптикалық импульстік жауап

Оптикалық импульс реакциясы - бұл 2D позициясындағы электр өрісінің қарқындылығы бірлік амплитудасының изотропты нүктелік көзі қандай да бір 3D күйінде орналастырылған кезде сенсор жазықтығында FOV-да. Электр өрісінің таралуы бойынша үш саты бар: нүктелік көзден табиғи кескін жазықтығына (яғни, микролендер массивінің жазықтығына) бару, микролендер массивінен өтіп, сенсор жазықтығына таралу.

1-қадам: Тарату мақсатты айқындайды

Дөңгелек апертурасы бар объектив үшін табиғи кескін жазықтығындағы толқын эмитенттен басталды скалярлық Дебай теориясының көмегімен есептелуі мүмкін:[7]

,

қайда - мақсаттың фокустық қашықтығы; оны ұлғайту болып табылады. толқын ұзындығы. жартысының бұрышы сандық апертура ( - сынаманың сыну көрсеткіші). микроскоптың аподтау функциясы болып табылады ( Abbe-sine түзетілген мақсаттар үшін). нөлдік тәртіп Бессель функциясы бірінші типтегі және сәйкесінше нормаланған радиалды және осьтік оптикалық координаттар:

,

қайда толқын нөмірі.

2-қадам: Микролендер массивіне назар аудару

Әрбір микролендерді фазалық маска ретінде қарастыруға болады:

,

қайда бұл микролинзалардың фокустық қашықтығы және - бұл микролендер центрінен нүктеге бағытталған вектор микролендерде. Мұны байқаған жөн болғанда ғана нөлге тең болмайды микролендердің тиімді таралу аймағында орналасқан.

Осылайша, жалпы микролендер массивінің тарату функциясы келесі түрде ұсынылуы мүмкін 2D тарақ функциясымен шиыршықталған:

,

қайда бұл микролинзаның биіктігі (айталық, өлшемі).

3-қадам: сенсорға жақын өрісті тарату

Толқындық фронттың қашықтыққа таралуы түпнұсқа кескін жазықтығынан сенсор жазықтығына дейін a-мен есептеуге болады Френель дифракциясы ажырамас:

,

қайда толқындық фронт - бұл жергілікті бейнелеу жазықтығынан бірден өтеді.

Сондықтан бүкіл оптикалық импульсті реакцияны конволюция түрінде көрсетуге болады:

.

Өлшеу матрицасын есептеу

Оптикалық импульстік жауапқа ие бола отырып, кез-келген элемент өлшеу матрицасында келесідей есептеуге болады:

,

қайда пикселге арналған аймақ және вокселге арналған көлем . Салмақ сүзгісі PSF вокселдің шетінде емес, центрінде көбірек үлес қосатындығына сәйкес келеді. Сызықтық суперпозиция интегралы әр шексіз көлемде фторофорлар болады деген болжамға негізделген олардың тез, кездейсоқ ауытқуларын ескере отырып, біртұтас емес, стохастикалық эмиссия процесін бастан кешіру.

Кері есепті шешу

Өлшемдердің шулы сипаты

Тағы да, өткізу қабілетінің шектеулі болуына байланысты фотон атылған шужәне үлкен матрицалық өлшеммен кері есепті тікелей шешу мүмкін емес: . Оның орнына дискретті жарық өрісі мен FOV арасындағы стохастикалық қатынас көп ұқсас:

,

қайда бұл бейнелеу алдында өлшенген фондық флуоресценция; бұл Пуассон шуы. Сондықтан, енді фотоэлектрондар бірлігінде Possion үлестірілген мәндері бар кездейсоқ векторға айналады.

Ықтималдықтың максималды бағасы

Өлшенген жарық өрісінің ықтималдығын максимизациялау идеясына негізделген белгілі бір FOV берілген және фон , Ричардсон-Люсидің қайталану схемасы мұнда тиімді 3D алдау алгоритмін ұсынады:

.

оператор қайда матрицаның диагональды аргументі болып қалады және оның диагональдан тыс элементтерін нөлге қояды.

Қолданбалар

Функционалды нейрондық бейнелеу үшін жарық далалық микроскопия

Стэнфорд университетіндегі алғашқы жұмыстан бастап Light Field микроскопиясын қолдана отырып кальций бейнесі личинкада зебрбиш (Данио Рерио),[8] Қазіргі уақытта жарық миы микроскопиясын бірқатар мақалалар функционалды нейрондық бейнеге, соның ішінде бүкіл мидың нейрондық динамикалық белсенділігін өлшеуге қолданды C. elegans,[9] личинка зебрабишінде мидың бүкіл бейнесі,[9][10] жеміс шыбындарының миында кальций мен кернеу белсенділігінің датчиктерін бейнелеу (Дрозофила) 200 Гц дейін,[11] және виртуалды ортада жүретін тышқандардың гиппокампасында 1мм х 1мм х 0,75мм көлеміндегі жылдам кескін.[12] Бұл қолдану аймағы есептеуіш оптика мен нейрологияның қиылысында қарқынды дамып келе жатқан аймақ болып табылады.[13]

Сондай-ақ қараңыз

Әдебиеттер тізімі

  1. ^ а б в г. Левой, Марк; Нг, Рен; Адамс, Эндрю; Төменгі колонтитул, Матай; Horowitz, Mark (2006). Light Field микроскопиясы. ACM SIGGRAPH 2006 қағаздары. SIGGRAPH '06. 924–934 беттер. дои:10.1145/1179352.1141976. ISBN 978-1595933645.
  2. ^ а б Брокстон, Майкл; Гросеник, Логан; Янг, Самуил; Коэн, Ной; Андалман, Аарон; Дейзерот, Карл; Левой, Марк (2013-10-21). «Толқындық оптика теориясы және жарық өрісінің микроскопына арналған үш өлшемді деконволюция». Optics Express. 21 (21): 25418–25439. Бибкод:2013OExpr..2125418B. дои:10.1364 / OE.21.025418. ISSN 1094-4087. PMC 3867103. PMID 24150383.
  3. ^ Левой, Марк; Ханрахан, Пэт (1996). Жеңіл өрісті көрсету. Компьютерлік графика және интерактивті әдістер бойынша 23-ші жыл сайынғы конференция материалдары. SIGGRAPH '96. 31-42 бет. дои:10.1145/237170.237199. ISBN 978-0897917469.
  4. ^ а б Нг, Рен (2005). «Фурье кесіндісіндегі фотосуреттер». ACM SIGGRAPH 2005 қағаздары. СИГРАФ '05: 735-744. CiteSeerX 10.1.1.461.4454. дои:10.1145/1186822.1073256.
  5. ^ Вайш, V .; Гарг, Г .; Талвала, Е .; Антунес, Э .; Уилберн, Б .; Хоровиц, М .; Левой, М. (маусым 2005). Синтетикалық диафрагманы қарау трансформасының ығысу-фактор факторизациясы көмегімен фокустау. 2005 ж. IEEE компьютерлік қоғамның компьютерлік көзқарас және үлгіні тану бойынша конференциясы (CVPR'05) - семинарлар. 3. б. 129. дои:10.1109 / CVPR.2005.537. ISBN 978-0-7695-2372-9.
  6. ^ Шведлоу, Джейсон Р .; Седат, Джон В .; Агард, Дэвид А. (1996). Янссон, Питер А. (ред.) Кескіндер мен спектрлердің деконволюциясы (2-ші ред.). Орландо, Флорида, АҚШ: Academic Press, Inc., 284–309 бет. ISBN 978-0123802224.
  7. ^ Гу, Мин (2000). «Жетілдірілген оптикалық бейнелеу теориясы». Жетілдірілген оптикалық бейнелеу теориясы. Бибкод:2000aoit.conf ..... G.
  8. ^ Гросеник, Логан; Андерсон, Тодд; Смит, Стивен (2009-06-28). Нейрондық ансамбльдерді in vivo бейнелеу үшін серпімді көзді таңдау. Биомедициналық бейнелеу бойынша IEEE Халықаралық симпозиумы: нанодан макроға дейін. 1263–1266 бб. дои:10.1109 / ISBI.2009.5193292. ISBN 978-1-4244-3931-7.
  9. ^ а б Преведель, Роберт; Юн, Янг-Гю; Гофман, Максимилиан; Пак, Никита; Ветштейн, Гордон; Като, Саул; Шредель, Тина; Раскар, Рамеш; Циммер, Мануэль (2014-05-18). «Жарық өрісіндегі микроскопияны қолдана отырып, нейрондық белсенділікті бір мезгілде бүкіл жануарларға 3D бейнелеу». Табиғат әдістері. 11 (7): 727–730. дои:10.1109 / ISBI.2009.5193292. PMC 4100252. PMID 24836920.
  10. ^ Конг, Лин; Ванг, Сегуан; Чай, Юминг; Ханг, Вэй; Шан, Чунфэн; Ян, Вэнбин; Бай, Лу; Ду, Джулин; Ванг, Кай (2017-09-20). «Еркін дернәсіл зебрабишасы (Danio rerio) кезіндегі жүйке белсенділігін миға жылдам бейнелеу». eLife. 6. дои:10.7554 / eLife.28158. PMC 5644961. PMID 28930070.
  11. ^ Аймон, Софи; Катсуки, Такео; Гросеник, Логан; Брокстон, Майкл; Дейзерот, Карл; Сейновский, Терренс; Гринспан, Ральф (2017-09-02). «Ересек дрозофилада мидың қоздырғышы мен мінез-құлқына жауап беру кезінде жылдам бүкіл бейнесі». bioRxiv 10.1101/033803. дои:10.1101/033803. Журналға сілтеме жасау қажет | журнал = (Көмектесіңдер)
  12. ^ Гросеник, Логан; Брокстон, Майкл; Ким, Кристина; Листон, Конор; Пул, Бен; Янг, Самуил; Андалман, Аарон; Шарф, Эдвард; Коэн, Ной; Ижар, Офер; Рамакришнан, Чару; Гангули, Сурья; Суппес, Патрик; Левой, Марк; Дейзерот, Карл (2017-05-01). «Сүтқоректілер миындағы үлкен ұлпалар көлеміндегі жасушалық-белсенділік динамикасын анықтау». bioRxiv 10.1101/132688. дои:10.1101/132688. Журналға сілтеме жасау қажет | журнал = (Көмектесіңдер)
  13. ^ «Нейровизуалдық жүйеде жарық далалық микроскопия».